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核酸的定量是雙光束紫外分光光度計(jì)使用頻率較高的功能
發(fā)布日期：2017-07-05 瀏覽次數(shù)：2072
核酸的定量是雙光束紫外分光光度計(jì)使用頻率較高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸進(jìn)原液和稀釋液的體積，爾后測試空缺液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的題目。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上，雙光束紫外分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，答應(yīng)吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的正確度和度。如EppendorfBiophotometer的正確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值好在0.1-1.。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過雙光束紫外分光光度計(jì)的測試范圍）。后是操縱因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空缺液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空缺液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操縱事項(xiàng)。
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